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本研究成果は，2014年5月4日（英国時間）に英国科学雑誌「Nature Chemistry」のオンライン速報版で公開されました。

研究のポイント

• バイオマーカーである复雑な生体分子に応答して溶けるヒドロゲルの开発に成功
• 水とゲル化剤と酵素を混ぜるだけで简単に作製できる
• 简便で手軽な诊断材料や抗体を症状に応じて投与できる薬物放出材料として期待

研究の背景と経纬

　水を媒体とするヒドロゲルは，その生体适合性の高さから，诊断材料，薬物放出担体，细胞培养基材など，さまざまな医疗応用が期待される魅力的な材料です。このようなヒドロゲルが特定の分子の存在やその量を识别して溶けたり，再度固まったりできれば，高度な机能を持つ新しい医疗材料の开発につながると期待されます。しかし，これまでに开発されたヒドロゲルが识别できる分子は，构造が単纯なものに限定されていました。また，识别の対象となる标的分子ごとに新たなゲル化剤の设计と开発が求められ，その都度多大な労力を必要としていました。さらに复数の标的分子が同时に存在するかどうかを见分けるヒドロゲルの开発に関しては，その设计指针さえありませんでした。

研究の内容

　本研究グループは，小分子化合物が自律的に构造を作り出す「自己组织化注１）」という现象によってナノサイズ（ナノは１０亿分の１）の构造体を开発し，その机能化に取り组んできました。とくに，水中でナノサイズの极细繊维（ナノファイバー）となり，そのナノファイバーが络み合うことでヒドロゲル（超分子ヒドロゲル）を形成する小分子化合物（ゲル化剤）の高机能化を进め，非常に低浓度でゲル化する化合物の开発に成功してきました（図１）。
　今回，それらの知见を基に，酸化反応あるいは还元反応によって溶けるという特徴をもった反応性超分子ヒドロゲルをそれぞれ开発しました（図１ａ）。

(1) 酸化反応応答型ヒドロゲル

　酸化反応によって溶けるヒドロゲルを形成するゲル化剤（ＢＰｍｏｃ－Ｆ３）は，活性酸素种（ＲＯＳ）の中で过酸化水素を选択的に见分けて溶けることを明らかにしました（図２ａ）。过酸化水素は，各种オキシダーゼ（酸化酵素）がその基质を酸化する时に生成することが知られています。そこで，ＢＰｍｏｃ－Ｆ３が形成するヒドロゲルにいろいろなオキシダーゼを埋め込んだところ，内包したオキシダーゼの基质をヒドロゲルに添加した时にのみゲルが溶けることを见いだしました（図２ｃ）。例えば，グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）を内包させたヒドロゲルは，グルコース（ブドウ糖）のみに応答して溶け（図２ｃの１列目），サルコシンオキシダーゼ（ＳＯｘ）を内包させたヒドロゲルは，サルコシンのみに応答して溶ける（図２ｃの２列目）ことを実証しました。この结果は，ヒドロゲルの中でオキシダーゼが十分にその活性を保持し，基质を酸化する际生成した过酸化水素がヒドロゲルを溶かしているということを意味しています（図２ｄ）。つまり，１种类のゲル化剤が形成するヒドロゲルに酵素を选んで混合するだけで，さまざまな生体分子（グルコース（糖尿病のバイオマーカー），サルコシン（前立腺癌のバイオマーカー），尿酸（痛风のバイオマーカー），コリンなど）に応答して溶けるヒドロゲルが作製できることになります。このように多様な生体分子を见分けることのできるヒドロゲルはほかに类をみません。さらに，ヒト血浆を用いた実験では，高血糖症に対応する浓度のグルコースが存在する时だけ溶けるヒドロゲルも作製可能であることを実証しており（図２ｂ），今后，诊断材料の开発などの医疗応用に幅広い贡献が期待できます。

(2) 還元反応応答型ヒドロゲル

　还元反応によって溶けるヒドロゲルを形成するゲル化剤（ＮＰｍｏｃ－Ｆ２）は，ニトロ还元酵素（ＮＲ）注２）と呼ばれる酵素を内包させておくことで，还元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の存在を选択的に见分けることを明らかにしました（図３ａ）。ＮＡＤＨは，ＮＡＤ依存性酵素が基质を酸化する际に酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）から再生されることが知られています。そこで，ＮＡＤ依存性酵素の１つである乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）とＮＡＤ＋とＮＲを，ＮＰｍｏｃ－Ｆ２が形成するヒドロゲルに同时に内包させたところ，乳酸を添加した时にヒドロゲルが溶けることを见いだしました（図３ｂ）。この结果は，ゲルの中で乳酸がＬＤＨによって酸化され，その际ＮＡＤ＋から再生されたＮＡＤＨがゲル化剤と反応し，ヒドロゲルを溶かしていることを示しています（図３ｃ）。ちなみに乳酸はがん组织周辺で浓度が上昇することが知られています。

(3) 酸化反応応答型ヒドロゲルと還元反応応答型ヒドロゲルの複合化

　さらに，上记の２种类のゲル化剤および数种类の酵素を混合したヒドロゲルは，それぞれが识别する生体分子が同时に存在する时のみに溶けることも実証しました。すなわち，グルコースのみ，あるいは，ＮＡＤＨのみでは溶けず，グルコースとＮＡＤＨが両方存在する时においてのみ溶ける自律応答型のヒドロゲルの开発に成功しました（図４）。また，そのヒドロゲルに蛍光色素を修饰した抗体(滨驳骋)を闭じ込めておくと，グルコースとＮＡＤＨが両方存在する时においてのみ抗体を放出することも明らかにしました（図４ｃ）。

今后の展开

　今回开発したヒドロゲルは，水とゲル化剤と酵素を混ぜるだけで简単に作製できます。さらに抗体のようなバイオ医薬品をそのヒドロゲルのなかに闭じ込めておき，バイオマーカーの存在を识别し放出させることも可能です。
　このように，化学反応の特异性を组み込んだ小分子化合物からボトムアッププロセス注３）で作成したナノファイバーからなるヒドロゲルと酵素反応を组み合わせる手法は広く一般化することが可能であり，诊断材料，薬物放出材料，再生医疗用细胞培养基材など，さまざまな医疗材料に「これまでにない自律的に考えて応答するという新たな机能」を付与できると期待されます。

参考図

図１　ゲル化剤の分子构造と自己组织化および化学反応の模式図
（クリックすると拡大します）

ａ：酸化反応に応答するゲル化剤（ＢＰｍｏｃ－Ｆ３）と还元反応に応答するゲル化剤
　　（ＮＰｍｏｃ－Ｆ２）の分子构造

ｂ：ＢＰｍｏｃ－Ｆ３の自己组织化および过酸化水素に応答した酸化反応の模式図

ｃ：ＢＰｍｏｃ－Ｆ３が形成するナノファイバーの顕微镜写真
　　（左：透过型电子顕微镜（ＴＥＭ）写真，右：共焦点レーザ走査型顕微镜（ＣＬＳＭ）写真）

図２　酸化反応応答型ヒドロゲル（ＢＰｍｏｃ－Ｆ３）
（クリックすると拡大します）

ａ：バイアル瓶中に作成した过酸化水素に选択的に応答するヒドロゲルの写真　（ヒドロゲルはバイアル瓶を逆さにしても流れ落ちないが，过酸化水素を添加后のサンプル（Ｈ２Ｏ２とラベル：左から２番目）は溶けて（ゾル化し）流れている）。

ｂ：スライドガラス上にスポットしたヒドロゲル（直径约４ｍｍ）にグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）を内包させ，异なる浓度のグルコースを含むヒト血浆を添加し，水で洗った后のスライドガラスを上から撮影した写真（ヒドロゲルは水で洗ってもスポットとして残っているが，高浓度のグルコースを含むヒト血浆を添加したヒドロゲルは溶けてゾルとなり，洗い流され残っていない）。

ｃ：スライドガラス上にスポットしたヒドロゲル（直径约４ｍｍ）にオキシダーゼを内包させ，标的分子を添加し，水で洗った后のスライドガラスを上から撮影した写真（ヒドロゲルは水で洗ってもスポットとして残っているが，溶けたゾルは洗い流され残っていない）。ＧＯｘ：グルコースオキシダーゼ，ＳＯｘ：サルコシンオキシダーゼ，ＣＯｘ：コリンオキシダーゼ，ＵＯｘ：尿酸オキシダーゼ。

ｄ：オキシダーゼを内包したヒドロゲルがそれぞれのオキシダーゼの基质を添加した时に応答することを模式的に示したスキーム。

図３　还元反応応答型ヒドロゲル（ＮＰｍｏｃ－Ｆ２）
（クリックすると拡大します）

ａ：バイアル瓶中に作成したＮＡＤＨに选択的に応答するヒドロゲルの写真（ヒドロゲルはバイアル瓶を逆さにしても流れ落ちないが，ＮＡＤＨを添加后のサンプル（ＮＡＤＨとラベル：右）は溶けて（ゾル化し）流れている）。

ｂ：スライドガラス上にスポットしたヒドロゲル（直径约４ｍｍ）に酵素およびＮＡＤ＋を内包させ，标的分子を添加し，水で洗った后のスライドガラスを上から撮影した写真（ヒドロゲルは水で洗ってもスポットとして残っているが，溶けたゾルは洗い流され残っていない。右から２番目と３番目のスポットを比较すると乳酸を添加することでヒドロゲルが溶けていることが分かる）。ＬＤＨ：乳酸脱水素酵素，ＮＲ：ニトロ还元酵素。

ｃ：ＬＤＨとＮＲとＮＡＤ＋を内包したヒドロゲルが乳酸あるいはＮＡＤＨを添加した时に応答することを模式的に示したスキーム。

図４　酸化反応応答型ヒドロゲル（ＢＰｍｏｃ－Ｆ３）
（クリックすると拡大します）

ａ：スライドガラス上にスポットした复合化ヒドロゲル（直径约４ｍｍ）に，标的分子を添加し，水で洗った后のスライドガラスを上から撮影した写真（ヒドロゲルは水で洗ってもスポットとして残っているが，溶けたゾルは洗い流され残っていない。グルコースとＮＡＤＨを両方添加したスポット（右下）のみヒドロゲルが溶けていることが分かる。ＮＡＤＨとグルコースをインプット情报としてＡＮＤ型の论理演算を実行してゲルが溶けていることを意味する结果である）。

ｂ：复合化したヒドロゲルがグルコースおよびＮＡＤＨ両方を添加した时のみ応答することを模式的に示したスキーム。

ｃ：ヒドロゲルに蛍光色素を修饰した抗体を闭じ込めておき，その上にバッファーを加え，さらに，グルコースのみ（0,1），ＮＡＤＨのみ(1,0)，グルコースとＮＡＤＨの両方(1,1)，あるいはいずれも含まない(0,0)水溶液を添加し，８时间后に撮影した写真（蛍光を可视化）。ヒドロゲルからバッファー中に放出された抗体の割合（％）の时间変化を蛍光强度から求めたプロット。

用语解説

• 注１）自己组织化
  ：分子などが非共有结合性相互作用などによって，自分自身で高次の大きな组织や构造を作り出す性质
• 注２）ニトロ还元酵素（ＮＲ）
  ：ＦＭＮ（フラビンモノヌクレオチド）を补因子とし，ニトロ基を还元する酵素。活性化にＮＡＤＨを必要とする
• 注３）ボトムアッププロセス
  ：分子や原子といった小さな材料を部品として，その组み合わせから最终的に大きな材料やシステムを作り上げる方法。大きな材料を削る?切るなどして微细に加工し，半导体などの小さな材料を作成するトップダウンアプローチとは反対の方法

论文タイトル

Installing Logic-Gate Response to a Variety of Biological Substances in Supramolecular Hydrogel-Enzyme Hybrids
（超分子ヒドロゲル－酵素ハイブリッドへのさまざまな生体物质に対する论理演算応答の导入）